[내가 보려고] 생화학(1) chapter02 정리
*정확한 내용이 아닐 수 있음. 참고용으로만 봐주세요.* 생화학 2단원 정리 2.1 알파 탄소에 4가지의 다른 그룹이 연결되어 있는 구조를 키랄이라 한다. L form과 R form 이 있다. 대부분의 단백질은 L
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*정확한 내용이 아닐 수 있음. 참고용으로만 봐주세요.*
생화학 3단원
3-1. 단백질 정제는 기능 이해하는 데 첫 번째 단계이다.
단백질은 화학적 성질의 차이를 이용하여 정제할 수 있다.
assay 라는 분석시험을 통해 정체 가능. 예를 들어 효소의 경우 효소 활성도를 측정한다.
락테이트와 nad+를 락트산 탈수소효소를 이용해 합성하면 nadh가 나온다. 이 환원된 nadh는 340nm에서 빛을 흡수하는데 nad+는 빛을 흡수하지 않는다. 이 빛 흡수정도에 따라 반응 진행 알수잇다.
단백질을 정제하려면 세포에서 나와야겠다.
분별 원심 분리 (differential centrifugation) 각 용어를 잘 정리하자.
세포막을 파열시켜서 세포 파쇄액을 만든다. 이를 원심분리하면 pellet 과 supernatant 가 나온다. 약 500g 로 햇을 때 pellet은 nuclear fraction 이고
10000g 이면 미토콘드리아, 100000g 이면 microsomal 이 pellet 으로 나온다.
즉 핵이 밀도가 제일 크다. final supernatant 은 cytoplasm 이다. (세포질)
salting out (염석)
단백질을 용해도에 따라 분리하는 방법으로 고농도 조건에서는 염의 농도가 높아질수록 용해도가 감소하면서 단백질이 침전한다. 단백질마다 침전하는 염의 농도가 달라서 분리 가능
반대로 저농도 조건에서는 염의 농도가 높아질수록 용해도도 높아진다.
dialysis, 투석
다공성인 cellophane bag을 통해 단백질을 작은 분자들로부터 분리가 가능하다.
이는 염 또는 그 밖의 작은 분자들을 제거하는 데에 쓸모가 있지만 효과적으로 구별은 못할 듯.
gel- filtration 크로마토그래피
단백질을 사이즈에 따라 분리하는 방법
유리관 컬럼은 porous beads , 다공성 구슬 로 이루어짐
이 구슬을 지나갈 때 큰 단백질은 구슬에 들어갈 수 없고 제일 먼저 빠져나온다.
작은 단백질은 구슬로 들어가고 그러므로 분리되는 시간이 길다.
ion exchange 크로마토그래피
단백질의 알짜 전하에 따라 분리하는 방법
이번엔 구슬이 전하를 띤다. 같은 전하를 가지고 있다면 빨리 나올 것이고, 반대 전하를 가지고 있다면 구슬과 결합한다. 이후 용리용 완충액에 있는 염의 농도를 증가하여 용리가능. 그 염이랑 단백질의 작용기들이 대롱과 결합하기 위해 경쟁하기 때문
양이온 교환 – 음으로 하전된 구슬(carboxymethylcellulose, CM group)과 양이온 작용기들이 결합하려 한다.
음이온 교환 – 양으로 하전된 구슬(diethylaminoethylcellulose, DEAE group)과 음이온 작용기들이 결합.
-affinity chromatography
단백질이 특정 화학 작용기에 대한 큰 친화력을 가지는 성질을 이용하는 크로마토그래피다.
-HPLC
액체 크로마토 그래피에 고압을 가해서 분리 효능을 증가시켰다.
-gel eletrophoresis (젤 전기이동)
폴리뉴클레오타이드는 NH+ OH- 이라서 net charge 가 0이다. SDS binding을 통해 이는 –를 띠기 때문에 +로 이동한다. 이를 이용한 분석법이다.
성분비에 따라 SDS가 달라진다 5%라고 하면 methylenebisacrylamide 가 5% 들어있다는 뜻이다.즉 다리역할이 많으면 많을수록 공간은 좁아진다. 작은 물질을 분리할 때는 퍼센트가 높은걸 사용하고 큰 걸 분리할 때는 퍼센트가 큰 걸 쓰면 된다.
-isoelectric focusing (등전점 전기이동)
pka에 의해 단백질을 분리하는 것 ( pka가 작을수록 산성 클수록 염기성 )
단백질의 알짜 전하가 0이 될 때의 pH 값을 PI값이라고 한다.
자, 잘 이해하자.
base를 넣으면 cooh의 h가 하나 떨어져 나간다. 이는 co2-를 생성하고 charge가 하나 줄어든다. 이렇게 base를 넣어주면서 net charge가 0인점을 찾다.
만약 cooh가 많다면 pi값이 산성이고(pka는 작다.) 만약 NH3+가 많다면 pi값이 염기성이겠다. (pka는 크다.) 이렇게 다 단백질마다 다른데 이를 이용하는 것이 등전점 전기이동이다.
-two- dimensional electrophoresis
이는 젤 전기이동이랑 등전점 전기이동을 합한 것
-단백질 정제계획서 분석하기
total protein – 각 분획의 일부분의 단백질 농도를 결정
total activity – 일부분의 효소활성 * 전체부피 (total protein)
-침강계수
스베드베르그 단위로 나타냄.
s 값이 작을수록 원심력장에서 느리게 움직인다.
무거운 입자는 덜 무거운 것보다 빨리 침강한다.
-zonal centrifugation (기울기 원심분리)
침강계수들이 다른 단백질을 분리하는데 사용
< 면역학 >
antibody 항체는, 외부 물질의 존재 antigen 항원과 결합한다. 이는 면역반응의 한 단계
-항체
항체는 Fab domain 과 Fc domain 으로 이루어져 있다.
외부로부터 항원이 들어오면 비셀이 signal을 준다. -> 과량의 antibody를 만든다.
이를 이용하는게 백신! 바이러스의 일부 조각을 넣어줘서 항체를 미리 만든다.
종류가 두 종류가 있는데 (용어 잘 이해하기)
polyclonal antibodie
여러 다른 b 림프구에서 생성, 분비된 항체들을 말한다. 다양한 에피로프에 특이성을 가짐.
monoclonal antibodies
항체가 모두 동일. 한가지 항체를 생산하는 세포에 의해 생성되는 것이다.
그럼 이를 만드는 방법은 무엇이 있을까?
1. 생쥐에 antigen을 투입한다.
2. antibody를 생성하는 spleen cells을 분리한다.
3. 이를 생상주기가 빠른 myeloma cell (골수종 세포) 랑 spleen cell을 섞어준다.
- 즉 antibody 생성하는 특징 + 잘 자라는 특징을 합쳤다고 생각 (hybridoma cell)
4. 이를 mass culture에서 키우는 건 비싸니까 쥐에서 키워서 antibody를 추출한다.
-Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 면역 흡착제 (용어기억)
효소는 항체와 공유결합하고 있는데 이때 기질을 첨가하면 효소는 유색 생성물발생을 촉진하게 된다. 즉 색이 바뀌면 항원과 항체가 결합했다고 할 수 있다.
indirect ELISA
1. 항원을 바닥에 붙인다. -> 씻어버림 안붙은건 날라가겟지？
2. antibody 용액을 넣어준다 -> 씻어버림 만약 결합하는 항체가 아니였다면 날라가겠지?
3. 효소랑 결합한 antibody를 특이항체와 결합한다. ->씻어버림
만약 첫 번째 항체와 결합하지 않는 것이면 날라가겠지?
4. 기질을 첨가해서 효소-기질 결합을 만든다. 그러면 색이 관찰됨.
즉 색이 나왔다는 건 항원이 있고, 그와 결합한 항체가 있고 이와 또 결합한 효소항체가 존재했다. 라고 말할 수 있음.
sandwich ELISA
1. monoclonal 항체를 붙인다. -> 씻어버림
2. 항원을 첨가한다. -> 씻어버림 만약 결합하지 않는다면 용액에는 항체만 있겠지?
3. 효소와 결합한 두 번째 항체를 추가함 움직이지 않는 항원과 결합 ->=만약 항원이 없었더라면 이 효소와 결합한 항체는 씻겨나갔을 것이다.
4. 기질 첨가 색 나옴.
즉 이 말은 항체가 처음에 고정됐고 이와 상보적으로 결합하는 항원이 들어갔고 또 이와 결합하는 효소를 가진 항체가 들어왔고 기질로 인해 색이 나타났다.
- western blotting (웨스턴 블러팅)
1. SDS – polyacrylamide gel에서 polymer sheet 으로 찍어냄.
2. 찍어낸 곳에 primary 항체를 넣어준다. -> 씻어준다.
만약 항원이 없다면 (단백질이 없다면) 씻겨나갔을 것이다.
3. secondary 항체를 넣어준다. -> 씻어준다.
이는 효소와 결합하고 있으므로 형광표지를 보여주는 등 첫 번째 항체의 존재와 우리가 원하는 단백질의 위치를 알려주는 역할을 한다.
-co –immunoprecipitation
1. 추출액에 항체를 넣어준다. 이와 결합한 것들이 있다.
2. 단백질 A 구슬을 넣어준다. 이는 항체와 결합하고 낮은 속도로 돌려주면
이 구슬이 가라앉는다. 이를 연구에 사용한다.
- mass spectrometry
펩타이드랑 단백질 특성을 알아내는데 좋다.
ELISA는 단백질 탐지만 할 뿐 이 방법으로는 분석물질의 원자조성을 알 수 있다.
MALDI – TOF 질량분석기
1. 모체에 묻혀 있는 단백질 시료에 레이저 광선을 쪼여서 이온화 한다.
2. 전기장이 생성된 이온을 비행관을 지나서 검출기쪽으로 가속한다.
3. 가벼운 이온이 먼저 도착하겠지?
4. 이온화하는 레이저의 순간파동은 TOF를 잴 시계를 작동시킨다.
- 에드만 분해
단백질의 아미노산 순서를 결정하는 방법 중 하나
1-2-3-4-5 이렇게 연결되어 있는 상황에서
1. N말단 아미노산에 phenyl isothiocyanate를 결합한다.
2. 곧이어 분해가 일어남 이는 PTH-아미노산을 생성 이는 분광법으로 확인 가능
라운딩 계속 진행
( 라운딩 할 때 펩타이드 양 줄어드니까 최대 50라운드까지 가능 , 반면에 mass spec 은 나노까지 가능하다!)
질량분석기에서 5개의 딸 세포가 발견되는데 가장 처음 떼어낸 사슬이 가장 무겁겠지?
각각 간격은 아미노산을 가리키고 이들의 순서는 곧 아미노산 순서를 말한다.
즉 일부 조각의 아미노산 순서는 알 수 있는데 전체로 보면 잘 모른다.
overlap peptides를 이용해서 알아낼 수 있다.
다른 효소로 자른것들로 순서 알아내고 이 둘을 합친다.
예를들어 chymotrypsin 은 방향족 잔기와 덩치가 큰 무극성 잔기들에서 쪼개기에 trypsin에서 자르는 것과 다르다. 이 둘을 합쳐서 원래의 순서를 알면 된다.
-펩타이드끼리 합성하는 방법
고체상 방법
1. c말단 아미노산을 고체상에 고정시킨다.
2. 아미노기의 보호기 제거한다. (t-Boc 제거, 이때 t-BOC는 아미노기가 다른물질과 결합하는 경우가 있어서 보호해주는 것이다. )
3. 보호기 제거해서 자유로워진 아미노산을 DCC로 활성화된 카복실기과 짝지었다.
4. 반복해서 완성된 펩타이드를 유리시킨다.
X-선 결정학과 NMR 분광법으로 삼차원 단백질 구조 알 수 있다.
-X-선 결정학 : x선이 가장 좋은 분해능을 가진 이유는 x선 파장이 공유결합의 길이와 거의 같은 길이이기 때문이다.즉 3차구조 더 디테일하게 얻을 수 있다. 하지만 수용액 상태에서는 조금 형태가 바뀐다.
-핵자기 공명분광법 : 수용액 상에서 보이는 구조 그대로 분석가능 하지만 정확하고 복잡한 구조는 밝힐 수 없다.
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