[내가보려고] 생화학(1) chapter.05 정리

*정확한 내용이 아닐 수 있음. 참고용으로 봐주세요.*

생화학 5단원

-restriction enzyme (제한효소)

특정 염기 순서를 인식하고 이중나선의 양쪽 가닥을 특정한 자리에서 쪼갠다.

(포스포다이에스터결합을 가수분해한다.

어떻게 쪼개냐에 따라 이중구조가 유지될 수도 있고 아닐 수도 있음.

자른 조각들은 palindromic 하다. 즉 180도 회전에 대칭관계에 있음

 

- gel electrophoresis

젤 전기이동으로 제한효소 조각들 존재 알 수 있음.

두가지가 있는데 하나는 폴리아크닐아마이드젤 이는 1000개 정도 염기쌍 가진 dNA조각

아가로스 젤은 이보다 더 큰 (약 20kd까지) DNA조각 분리가능.

이들은 ethidium bromide로 착색하여 눈으로 볼 수 있음.

 

우리는 southern blotting 으로 주어진 DNA 시료안에 특정 염기순서를 가진 제한조각이 있는지 알아낼 수 있음

1. 조각들이 분리되어 있는 아가로스 젤을 nitrocellulose로 찍어낸다.

2. 우리가 원하는 DNA의 염기순서에 상보적인 32P로 표지된 DNA 탐침을 추가한다.

3. 자동방사선사진법이나 형광영상법 사용

4. 관측가능

 

노던블러팅 – RNA분석

웨스턴 블러팅- 단백질 분석 (비교할 수 있어야 한다.)

 

-DNA 복제를 멈추게 할 수 있다. 어떻게? 2‘,3’-dideoxy analog를 통해서!

이는 3‘에 oh가 없고 각각 다른 형광탐침을 가지고 있다.

 

똑같이 DNA복제시작한다.

1. primer가 template에 붙고 DNA polymerase와 unlabeled 된 dNTP가 있는 조건에서 복제전개.

2. 여기에 형광탐침이 labeled 된 ddNTP를 과량 넣어준다.

유사체가 결합하면 3‘oh가 없기 때문에 그다음 복제 진행 안된다. 복제끝

이것들은 전기이동 방법을 통해서 형광존재파악.

 

 

- DNA probe 랑 유전자 결합

늘어나는 사슬에 첨가되는 단위체 이름은 – deoxyribonucleoside 3’- phosphoramidites 라고 하는데 이는 5‘ 산소에 DMT 보호기, 3’ 인산기 산소에 베타CE 보호기 그리고 염기에도

보호기 있음

 

 

1. 들어오는 단위체의 3‘과 사슬의 5’이 만나 phosphite triester 결합을 이룬다.

이때 이 단위체의 5‘산소는 DMT로 보호되어 있으므로 반응성 없음. (산성조건에서 분리가능)

단위체 3‘에 결합되어있는 phosphoramidite 는 물과 반응하기 때문에 물이 없는 조건에서 진행.

2. I2를 사용하여 산화진행. phosphortriester 형성

3. dichloroacetic acid를 통해 DMT 제거

 

각 반응이 끝나면 resin으로부터 씻어내고 NH3를 사용해 모든 보호기 제거

 

 

-PCR (polymerase chain reaction)

증폭을 원하는 부분을 가진 DNA , 그 부분과 (양쪽 염기) 결합할 수 있는 한쌍의 primer(약 20개의 염기로 이루어짐) ,

dNTP, 열에 안정한 DNA polymerase (이는 온천에 사는 호열균으로부터 얻음) , mg2+이 있으면 PCR 가능

1. 타켓 시퀀스 + 프라이머 + dNTP 첨가 하고 온도를 95도로 올린다.

이중결합이였던 DNA가 단일결합으로 끊긴다.

2. 온도를 54도로 급격히 냉각하면 DNA가 다시 붙으려고 하는데 과량의 primer로 인해 붙진 못하고 primer 가 단일결합에 각각 결합한다.

(base가 뭐냐에 따라 필요한 primer 가 다르다. 55도에서 잘 안붙으면 이상한 물질로 나오겠지? 내가 만든 primer가 괜찮은지 알려주는 program 이 존재한다!)

 

3. 72도로 다시 열을 가하면 Taq polymerase로 합성 시작. 이때 원하는 목표 넘어까지 합성된다.

이 과정을 20~30번 까지 반복해서 진행한다.

두 번째 사이클에서 원하는 만큼의 길이 DNA 복제 가능 (short strands 생성)

 

-recombinant DNA 기술 ( 재조합 DNA 기술)

vector 는 내가 원하는 DNA조각을 잘 받아들일 수 있도록 고안되었다. 플라스미드와 람다파지가 있다.

제한효소로 플라스미드 자르면 부착성 말단이 형성되고 이와 결합할 수 있는 DNA조각 아무거나 삽입가능하다. 이때 DNA 조각도 같은 제한효소로 잘라야 한다. 이 중에서 플라스미드 스스로 다시 맞물리는 경우도 가능하다. 그리고 DNA 조각 여러개도 삽입 가능.

한가지의 제한효소로 잘랐다면 여러 조각을 붙일 수 있는 장점이 있지만 스스로 맞물리는 경우가 있음.

두가지의 제한효소로 잘랐을 때, 자기 자신은 맞물리지 않고 조각이 안으로 들어가지만,

하지만 한 조각만 들어간다. 여러조각 불가능? 그 이유가 a—b 이렇게 잘린 조각이 2개 있다고 치면 이 조각들이 합쳐져서 b—b 로 바뀐다. 따라서 플라스미드는 a-a인데 합성이 불가능해진다.

 

이후 DNA ligase(포스포다이에스터 결합 촉진)를 통해 결합할 수 있다.

 

만약 DNA 조각이 적절한 제한효소 부착성 말단이 없다면?

DNA linker를 연결해주면 된다. 이는 DNA 조각과 공유결합을 이룬다. 이후 제한효소로 자를면 부착성말단 생성!

 

-cloning vetor (해당 유전자가 활성과 관련있는지 찾는 것?)

내가 원하는 단백질을 만드는 DNA가 어떤 것인지 찾는 것 = cloning

reaction 엔자임을 자를 때 원하는 부분을 못자를 수 있고 람다 phase는 host 셀에 잘 들어가지만 사람의 유전자를 엠자임으로 잘라서 람다 phase에 넣고 cloning 한다면 경우의 수가 너무 많다. 람다 phase로 하면 힘든다.

mRNA를 이용하면 역전사를 이용해서 cDNA로부터 원하는 DNA를 찾으면 (cloning) 더 쉽다. 경우의 수가 줄어듦 이때 cDNA library를 expression vector에 넣음.

단백질을 만들려면 promoter 가 필요함.

항체결합으로 발견 (expression을 사용할 때), probe로 발견(cloning vector를 이용했다면)

 

 

다양한 DNA 조각들 합성가능한 polylinker를 가진다. (많은 제한효소자리 존재)

이는 reporter gene을 갖는데 이는 DNA가 잘 합성 되었는지 알려주는 유전자다.

만약 reporter gene 사이에 DNA 조각이 합성되면 이 gene은 활성이 없어지고 그 다음 반응을 하지 않는다.

예를 들어 pUC18에 DNA 조각을 합성하면 리포터유전자인 lacZa를 방해한다. lacZa는

베타- 갈락토스 분해효소를 만드는데 DNA 조각삽입으로 인해 비활성화 된다. 따라서 X-gal 분해를 못하고 흰색으로 결과가 나타남. 만약 삽입이 안됐다면 베타-갈락토스분해효소는 생성되고 X-gal이 분해되고 파란색으로 나타남.

 

-expression vector (발현 벡터를 통해 원하는 단백질 과량생산가능)

어떤 DNA 로부터 단백질을 만드는 것

원하는 유전자를 cloning 하는 것만으로 발현하기까지는 어렵다. 숙주에서 전사를 촉진해주는 프로모터가 삽입되어 있는 vector를 말한다. 이 프로모터로 인해 단백질 합성이 가능해졌고

이 발현벡터를 다른세포(숙주)에 넣고 단백질을 대량생산한다. 이때 원하는 단백질을 효과적으로 분리하기 위해 클로닝 자리 옆에 tag를 첨가한다.

 

- 람다 파지 (cloning 벡터로 이용)

이 람다 파지는 2가지의 길로 가는데

1. 세포 감염 후 lytic 경로 (용균) 로 가서 숙주를 파괴

2. 세포 감염후 lysogenic 경로 (용원) 로 가서 숙주의 DNA에 결합하여 비활성상태로 복제된다. 환경 변화가 생기면 활성을 띠어 용균경로로 간다.

감염 과정에서 대장균의 세포막 자체가 단단해서 플라스미드는 들어가기 어렵다 .

 

파지 돌연변이는 가운데 DNA를 제한효소로 잘라서 다른 외부 DNA 클로닝 가능

(이때 같은 제한효소로 잘라야 겠지?)

제한효소로 잘라서 그 스스로 다시 붙은 DNA는 너무 작아서 virion에 채워질 수 없음

 

-probe 탐침

이는 표적유전자에 상보적으로 결합하는 염기를 가지고 있고 서던블러팅에 사용된다.

탐침을 만들기 위해서는 표적유전자의 아미노산 순서를 알고 있어야 한다. 아미노산에 해당하는 코돈도 여러 가지 이므로 typ과 met 과 같이 1가지의 코돈만 가지는 아미노산을 이용하는게 효율적이다. 교과서에 나온 아미노산의 탐침을 만들기 위해서는 2*4*2*2*4*2 = 2의 8 개의 올리고뉴클레오타이드(짧은 가닥의 뉴클레오타이드) 만들어야 한다.

 

-genome library

genome 조각들이 람다 DNA 랑 결합하고 이게 vector로 들어간다. 이를 가지고 e.coli를 감염시킨다. 이를 통해 얻은 용균액은 사람 전체의 DNA를 대표하는 것이 된다.

그렇다면 genomic library에 내가 원하는 유전자가 있는지 어떻게 알까?

1. 박테리아가 자라고 있는 접시에 재조합 파지 용액을 덮는다.

2. 파지 입자가 박테리아를 감염시켰다면 용균 반점(plaque)이 생긴다.

2. nitrocellulose 막으로 복사물뜬다.

3. NaOH(세포막 잘라서 DNA 노출하게 하는 역할) 이랑 32p로 표지된 탐침을 넣어준다.

4. 우리가 원하는 유전자랑 탐침이랑 결합해서 방사선사진에 보이게 된다.

 

- cDNA

mRNA 로 만들어진 이중결합 DNA 다. reverse transcriptase를 이용해서 만들어짐

cDNA 만드는 방법

1. mRNA poly(A) 부분과 oligo(T) primer 랑 결합한다. (이때 poly(A) 부분은 왜 붙였지? 핵막 통과 잘하기 위해서 )

2. reverse trancriptase 랑 dNTP 넣어서 역전사진행

3. pH 증가시켜서 알칼리성에서 mRHA와 cDNA 분리한다. ( DNA는 알칼리 가수분해 저항성 가짐)

4. terminal transferase 로 3‘말단에 dG 잔기를 첨가.

5. oligo(C) primer , dNTP, reverse transcriptase 로 상보적인 가닥 합성

6. 이중결합 짜잔!

이 cDNA는 vector에 삽입할 수 있고 박테리에 삽입 가능 , 발현벡터에도 삽입 가능하다.

(생각해야 할 부분 – 람다보다 어떤 장점을 가질까?)

 

-cDNA 클론 선별방법

1. cDNA를 발현벡터에 넣고 (plasmid) 박테리아에 감염시킴( 된것도 있고 안된것도있고)

2. 복제접시에 옮겨서 박테리아 용균 시키고 단백질 방출

3. nitrocellulose 로 찍어냄

4. 방사선표지되어있는 항체 넣기

5. 원하는 단백질과 결합하여 박테리아 군체 확인가능

-박테리아를 이용한 프로인슐린 만들기

1. proinsulin 의 mRNA에 상보적인 cDNA 만들기

2. cDNA를 plasmid에 재조합함.

3. 이를 대장균에 감염시키고 그 안에서 프로인슐린 왕창 만듦.

재조합한 플라스미드는 대장균안에서 만들 수 없어.

 

- DNA 재조합 기술 ( 특정한 돌연변이 창조 가능하다)

올리고타이드 돌연변이 유발기법 (site – directed mutagensis) :

프라이머에서 인위적으로 하나의 염기 다르게 만든다. 이를 cDNA를 함유하고 있는 플라스미드랑 결합하게 해서 점 돌연변이가 있는 가닥을 생성한다.

( primer 가 상보적 가닥에 혼성화 하고 polymerase로 연장하고 ligase로 이중가닥 원형 DNA 만든다.)

이게 복제되면 반은 정상 반은 비정상 만들 수 있다. 따라서 site – directed mutagensis를 통해 100 % 다른 염기를 가진 것들만 만들어진다? 아니다!!!

따라서 이 부분이 바뀌었는데 활성이 변화되었다면 그 아미노산은 활성과 큰 연관이 있다고 말할 수 있다.

 

 

카세트 돌연변이:

한 ᄊᆞᆼ의 제한효소로 플라스미드의 관심있는 부분을 잘라낸다.

이후 새로운 부분을 첨가하여 돌연변이 플라스미드를 만들어 낼 수 있다.

 

역 PCR을 이용한 돌연변이:

제거하고 싶은 영역을 제한효소로 잘라버리고 이를 펼친다음에 프라이머로 제외된 전체 플라스미드의 증폭을 실시한다. 프라이머가 5‘ 인산기를 가지고 있다면 DNA ligase를 이용하여 원형으로 합쳐질 수 있음.

 

-차세대 염기 순서 분석법

파이로 염기 순서 분석법 (pyrosequencing)

1. DNA template를 우선 금속구슬로 고정한다.

2. primer를 연결하고 dNTP를 차례대로 넣어본다. 만약 상보적 결합하는 dNTP가 아니면

반응 안하고 그대로 남아있게 된다.

3. 과량의 dNTP를 제거하기 위해 apyrase를 첨가한다. 이는 dNTP를 dNMP + 2p로 바꿔준다.

4. 이후 해당하는 dCTP를 넣어줄 차례가 됐을 때 DNA polymerase 가 반응하게 되고 pp를 방출한다. 이 pp는 ATP sulfurylase로 인해 ATP로 바뀌고 이는 lucuferase를 통해 빛을 내게 된다. 이 빛은 농도에 비례해서 강한 빛을 내뿜으면 그만큼 많이 존재한다는 뜻.

(ATP sulfurylase 는 pp + adenylyl sulfate ATP + sulfate 로 바꿔준다. )

(lucuferase 는 ATP + luciferin을 light + oxyluciferin 으로 바꿔준다.)

 

- 진핵세포에 어떻게 DNA를 삽입할까?

1. calcium phosphate 로 침전된 외부 DNA를 세포가 흡수하게 한다.

2. 세포로 미량주입한다.

3. 관심있는 유전자를 가진 레트로바이러스를 이용해서 감염시킨다.

 

 

- RNA 간섭 ( 특정 단백질 못만들게 한다. )

1. 이중가닥 RNA를 Dicer 가 절단을 한다. 그 조각을 siRNA 라고 한다.

2. siRNA는 RISC로 옮겨진다. 여기서 passenger 가닥은 쪼개진다.

3. guide 가닥은 타켓 mRNA와 상보적 결합을 한다.

4. 이후 RISC에 있는 argonaute 가 이 mRNA를 분해한다. 단백질 생성 막았다.

 

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[내가보려고] 생화학(1) chapter.04 정리